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    Es werden Verfahren zum Kultivieren von Stammzellen (2, 3, 5), umfassend die Schritte Einführung von Zellmaterial, das mindestens eine Stammzelle (2, 3, 5) eines Donor-Organismus umfasst, in ein Wirts-Ei (4) mit einem Nährstoffreservoir, und Kultivierung des Zellmaterials im Wirts-Ei (4), eine Zellkultur und eine Zellkultureinrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.
    公开号:DE102004025086A1
    申请号:DE200410025086
    申请日:2004-05-21
    公开日:2005-12-15
    发明作者:Günter Prof. Dr. Fuhr；Charli Dr. Kruse
    申请人:Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV；
    IPC主号:C12M1-26
    专利说明:
    [0001] Dievorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Kultivieren von biologischenZellen, insbesondere von Stammzellen, Zellkulturen, die Stammzellenenthalten, und Zellkultureinrichtungen zum Kultivieren von biologischenZellen, insbesondere von Stammzellen.
    [0002] Inder Biologie und Medizin sind zahlreiche Verfahren zum Kultivierenvon biologischen Zellen allgemein bekannt. Das Kultivieren umfassteine vorbestimmte Vermehrung der Zellen unter bestimmten Kultivierungsbedingungen.Die Vermehrung umfasst das Wachstum von Zellmaterial, wobei ggf.eine Differenzierung von Zellen erfolgt. Das Kultivieren schließt allgemeinauch die Beeinflussung des Zellmaterials zur Bildung von differenziertenZellen, Zellaggregaten, Geweben, Organen oder Organismen ein.
    [0003] Esist bekannt, die Kultivierungsbedingungen in Oberflächenkultureneinzustellen, bei denen die Zellen auf einem Substrat angeordnetund mit einem Kultivierungsmedium bedeckt sind. Oberflächenkulturenbesitzen zwar Vorteile in Bezug auf die Möglichkeit der Beobachtung undEntnahme von Zellen. Nachteilig ist jedoch, dass in der Natur einZellwachstum auf festen Oberflächenin der Regel nicht auftritt, so dass die Kultivierungsbedingungender Oberflächenkulturnicht den natürlichenWachstumsbedingungen von Zellen entsprechen.
    [0004] Esist aus der Kultivierungstechnik auch bekannt, Zellen im nicht-adhärenten Zustandzum Beispiel in Schüttelkulturenoder in hängendenTropfen zu kultivieren. Diese Techniken besitzen jedoch Beschränkungen inBezug auf die Einstellung der Kultivierungsbedingungen und die erreichbarenDimensionen des kultivierten Zellmaterials.
    [0005] ZurSimulation natürlicherWachstumsbedingungen wird in DE 101 09 641 A1 ein Inkubator zur Aufnahmevon Nistgewebe beschrieben, der als synthetischer Uterus verwendetwerden soll. Die Anwendung dieses Inkubators ist sowohl aus ethischerSicht problematisch als auch wegen des komplexen technischen Aufbausfür anderweitigeKultivierungsaufgaben ungeeignet.
    [0006] Esist bekannt, Vogeleier zur Vermehrung von Viren zu verwenden. DieseAnwendung ist jedoch auf eine zahlenmäßige Vermehrung der Viren beschränkt.
    [0007] DieAufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zum Kultivierenbiologischer Zellen, insbesondere von Stammzellen bereitzustellen,mit denen die Nachteile der herkömmlichenTechniken überwunden werdenund die insbesondere eine Kultivierung von Zellen unter Kultivierungsbedingungenermöglichen,die möglichstgut an natürlicheWachstumsbedingungen angepasst sind. Die Aufgabe der Erfindung istes auch, eine neuartige Kultur bereitzustellen, in der die zu kultivierendenZellen unter möglichstnaturnahen Bedingungen sich vermehren und ggf. differenzieren. DieAufgabe der Erfindung ist es auch, eine verbesserte Zellkultureinrichtungbereitzustellen, mit der die Nachteile der herkömmlichen Kultivierungstechniken überwunden werden.
    [0008] DieseAufgaben werden mit Kultivierungsverfahren, Zellkulturen und Zellkultureinrichtungenmit den Merkmalen der Patentansprüche 1, 31 und 44 gelöst. VorteilhafteAusführungsformenund Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
    [0009] Verfahrensbezogenbasiert die Erfindung auf der Erkenntnis der Erfinder, dass dieKultivierungsbedingungen fürStammzellen insbesondere in Bezug auf die geometrischen Bedingungenund die Nährstoffversorgungden natürlichenWachstumsbedingungen am nächstenkommen, wenn die Kultivierung in einem Ei erfolgt. Das Ei umfasstallgemein eine Eizelle und mindestens eine Eihülle. Durch diese Komponentenwird ein natürlichesNährstoffreservoirgebildet. Erfindungsgemäß wird zumKultivieren ein Ei von einem Wirts-Organismus (im Folgenden: Wirts-Ei)verwendet, der sich vom Donor-Organismus unterscheidet, von demdas in das Wirts-Ei eingeführteZellmaterial stammt. Es erfolgt kein ausschließlicher Kerntransfer in dasWirts-Ei. Überraschenderweisekann das Wirts-Ei fürfremde Stammzellen oder daraus gebildete Materialien als Kultivierungssubstratverwendet werden, in dem ein Wachstum und ein Differenzieren dermindestens einen Stammzelle erfolgt.
    [0010] Einwesentlicher Vorteil der Erfindung ist es, dass eine Stammzellenkultivierungim Wirts-Ei eine vorbestimmte Differenzierung und ein geordnetesWachstum von Geweben, Organen oder Organismen ermöglicht.Es könneninsbesondere Embryonen fürdie Fischzucht oder Tierhaltung erzeugt und aufgezogen werden oderOrgangewebe von höherenLebewesen differenziert werden.
    [0011] Dadas Wirts-Ei ein eigenes Nährstoffreservoirenthalten muss, werden gemäß einerbevorzugten Ausführungsformder Erfindung Eier von Wirts-Organismen als Kultivierungssubstratverwendet, die nicht der Klasse der Säugetiere angehören. BeiSäugetierenerfolgt die Nährstoffversorgungwährendder Embryonalentwicklung direkt von der Mutter, so dass Säuger-Eierkein füreine längereEmbryonalentwicklung ausreichendes, eigenes Nährstoffreservoir enthalten.Im Übrigenkann der Wirts-Organismus in Abhängigkeitvon der konkreten Kultivierungsaufgabe und dem Donor-Organismusgewähltwerden. Vorteilhafterweise könnenerfindungsgemäß Wirts-Eieraus den taxonomischen Klassen Vögel,Fische, Amphibien, Reptilien und Insekten gewählt werden, deren Eier sämtlich über einausreichendes Nährstoffreservoirverfügen.Besonders bevorzugt gehörendie Donor- und Wirts-Organismen verschiedenen taxonomischen Einheiten,insbesondere Klassen, Familien oder Arten an, um die Beeinflussungder zu kultivierenden Stammzellen durch Fremdzellen möglichst geringzu halten. Bevorzugte Anwendungen der Erfindung bestehen in derEinführungvon Zellmaterial, das von Säuger-Organismenstammt, in Vogel- oder Reptilieneier, oder in der Einführung vonZellmaterial, das von Fischen einer ersten Art stammt, in Fischeiereiner anderen Art.
    [0012] Wenngemäß einerweiteren Ausführungsformder Erfindung zum Kultivieren des Zellmaterials ein unbefruchtetesWirts-Ei verwendet wird, könnensich in diesem vorteilhafterweise ausschließlich die fremden Zellen vermehren.Alternativ kann das fremde Zellmaterial in ein bereits befruchtetesWirts-Ei eingeführtwerden, wobei sich dann Vorteile für die Entwicklung eines optimalenNährstoffreservoirsim Wirts-Ei ergeben können. Beidieser Ausführungsformder Erfindung wird die im Wirts-Ei sich ggf. entwickelnde Keimscheibeentfernt oder de aktiviert, um das weitere Wachstum des fremden Zellmaterialsnicht zu stören.
    [0013] Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformder Erfindung umfasst das in das Wirts-Ei eingeführte und dort kultivierte Zellmaterialeine oder mehrere adulte Stammzellen, insbesondere adulte, multipotenteoder pluripotente Stammzellen, die aus einer exokrinen Drüse des Donor-Organismusstammen.
    [0014] Eswurde festgestellt, dass aus exokrinen Drüsen adulter Organismen überraschenderweisepluripotente Stammzellen mit einer hohen Wachstums- und Differenzierungsfähigkeitgewonnen werden können,die die Kultivierung im Wirts-Ei eines fremden Organismus aufgrundihrer starken und stabilen Wachstumsfähigkeit besonders gut tolerieren.Die mindestens eine im Wirts-Ei kultivierte Stammzelle stammt vorzugsweise ausexokrinem Drüsengewebevon einem Wirbeltier, z.B. einem Fisch, Amphibium, Reptil, Vogeloder Säuger, besondersbevorzugt von einem Primaten, insbesondere einem Menschen.
    [0015] Daszur Gewinnung von Stammzellen fürdie erfindungsgemäße Kultivierungverwendete exokrine Drüsengewebekann von einem erwachsenen Organismus, juvenilen Organismus odernicht-humanen fötalen Organismus,vorzugsweise einem postnatalen Organismus, stammen. Der Begriff "adult", wie in der vorliegendenAnmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadiumdes Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donororganismus,aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sindnicht-embryonale Stammzellen.
    [0016] Vorzugsweisewird das erfindungsgemäß kultivierteZellmaterial aus exokrinem Drüsengewebeaus einer Speicheldrüse,Tränendrüse, Talgdrüse, Schweißdrüse, ausDrüsendes Genital trakts, einschließlichProstata, oder aus gastro-intestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas,oder sekretorischem Gewebe der Leber isoliert. In einer stark bevorzugtenAusführungsformhandelt es sich dabei um acinäresGewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas,der Ohrspeicheldrüseoder Unterkieferspeicheldrüse.
    [0017] Vorteilhafterweisesind die aus diesen Donor-Geweben bereitgestellten Stammzellen leichtzu isolieren und in einer stabilen Langzeitkultur ohne Feederzellschichtoder spezielle Zusätzeim undifferenzierten Zustand zu halten. Der Begriff Feederzellen,wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst alle Zellen, diedas Wachstum der eigentlich zu kultivierenden Zellen dadurch fördern, dasssie Wachstumsfaktoren freisetzen und/oder eine extrazelluläre Matrixbereitstellen, bzw. die Differenzierung der Stammzellkultur verhindern.
    [0018] InStammzellkulturen der Erfinder haben die Zellen nach bisher mehrals 25 Passagen überein Jahr lang ihre Fähigkeitzur Selbsterneuerung und uneingeschränkten Teilung behalten unddie Kulturen sind weiterhin stabil. Diese Eigenschaft der adulten,pluripotenten Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe ist besonders vorteilhaftfür dieEinstellung definierter Startbedingungen beim erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren.
    [0019] Dieerfindungsgemäß verwendetenadulten Stammzellen könnenohne Zusatz spezieller Wachstums- oder Differenzierungsfaktorenauf einfache Weise zur Differenzierung angeregt werden, indem sieim Wirts-Ei unter räumlichenBedingungen kultiviert werden, welche für einen dreidimensionalen Kontaktder Zellen sorgen.
    [0020] Gemäß einerabgewandelten Ausführungsformder Erfindung wird im Wirts-Ei Zellmaterial kultiviert, das mindestenseine nicht-humane, embryonale Stammzelle enthält. Nicht-humane, embryonaleStammzellen sind vorteilhafterweise pluripotent und damit beim Kultivierenfür Differenzierungenin alle Keimblättergeeignet.
    [0021] Daserfindungsgemäß in dasWirts-Ei injizierte Zellmaterial kann gemäß einer weiteren Modifikation eineVielzahl von Stammzellen umfassen, die ein zusammenhängendesAggregat (oder: Zell- oder Gewebekörper) bilden. In diesem Fallkönnenvorteilhafterweise die Chancen verbessert werden, dass die Vitalität des Materialswährenddes Kultivierens erhalten bleibt. Des Weiteren können die Zell- oder Gewebekörper vordifferenziertsein, so dass der erfindungsgemäßen Kultivierungim Wirts-Ei eine bestimmte Differenzierungsrichtung aufgeprägt werdenkann.
    [0022] DieBildung der organoiden Körpererfolgt bei einer Vorkultivierung unter Kultivierungsbedingungen, beidenen ebenfalls ein dreidimensionaler Kontakt der Stammzellen gegebenist. In einer bevorzugten Ausführungsformerfolgt die Vorkultivierung in hängendenTropfen, wie sie fürembryonale Stammzellen bereits beschrieben wurde (Wobus et al.,Biomed. Biochim. Acta 47: 965-973 (1988)). Dieses Verfahren wirdnachfolgend in den Beispielen noch näher beschrieben. Es verstehtsich jedoch, dass alternative Kultivierungsverfahren, die für den gewünschtendreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen und dem Fachmann bekanntund verfügbarsind, ebenso verwendet werden können.Beispiele fürsolche alternativen Verfahren sind die Kultivierung in bewegterSuspensionskultur, die Kultivierung in einem elektromagnetischenFeldkäfigoder Laser-Tweezer, die Aussaat von nicht resuspendierten Primärzellenauf Kulturbödenoder die Kultivierung auf Oberflächen,an denen die Zellen nicht oder schlecht haften. Solche Oberflächen können z.B.Glas, Polystyrol oder mit einer Anti-Adhäsionsschicht behandelte Oberflächen, z.B.PTFE- oder Poly-HEMA-beschichtete Oberflächen, sein.
    [0023] Beider Vorkultivierung entwickeln sich aus adulten, pluripotenten Stammzellenspontan dreidimensionale Zellverbände oder Zellaggregate, welcheauch als "OrganoidBodies" oder organoideKörperbezeichnet werden. Diese organoiden Körper können in Suspensionskulturenoder Adhäsionskulturen überführt undweiter kultiviert werden. Bei ausreichender Nährstoffversorgung wachsen dieorganoiden Körperweiter und könnenDurchmesser von einigen Millimetern oder mehr erreichen. Die großen organoidenKörperzeigen eine gewebeartige Struktur und werden in diesem Stadium zurUnterscheidung von den einfachen Zellaggregaten auch als "Gewebekörper" bezeichnet.
    [0024] Bringtman die organoiden Körperwieder in Oberflächenkultur,entsteht aus auswachsenden einzelnen Zellen eine zelluläre Monoschicht,aus der Multilayerbereiche hervorgehen, aus denen spontan sekundäre organoideKörpermit vergleichbaren Eigenschaften wie denjenigen der primären organoidenKörpergebildet werden. Die erfindungsgemäß verwendbaren organoiden Körper können z.B.bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffseingefroren gelagert werden, ohne ihre Lebensfähigkeit, Vermehrungsfähigkeit,Wachstumsfähigkeitund Differenzierbarkeit zu verlieren.
    [0025] DieBildung von embryoiden Körperaus nicht-humanen, embryonalen Stammzellen erfolgt bei der Vorkultivierungunter analogen Kultivierungsbedingungen, insbesondere wie sie für embryonaleStammzellen bereits beschrieben wurden (siehe oben, Wobus et al.).
    [0026] DieEinführungoder Injektion des Zellmaterials in das Wirts-Ei kann mit an sich bekannten und für diesenZweck geeignete Verfahren, wie z. B. eine Injektion suspendiertenZellmaterials mit einer Kapillare oder Spritze erfolgen.
    [0027] Gemäß einerbevorzugten Ausführungsformder Erfindung erfolgt im Wirts-Ei ein differenziertes Wachstum desZellmaterials. In Abhängigkeitvon den geometrischen und ggf. von außen beeinflussten stofflichenBedingungen im Wirts-Ei differenzieren sich verschiedene Stammzellenin verschiedene Richtungen. Zellen, welche aus den ursprünglich injiziertenStammzellen, organoiden Körpernoder Gewebekörpernauswachsen, könnenin die verschiedenen Zelltypen aller drei Keimblätter differenzieren. Zur Differenzierungsind keine Differenzierungsfaktoren notwendig und die Zellen müssen auchnicht transplantiert werden, um zu differenzieren. Es kann jedochvon Vorteil sein, solche Differenzierungsfaktoren einzusetzen, umgezielt größere Mengeneines bestimmten Zelltyps herzustellen. Solche Differenzierungsfaktorensind im Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. bFGF ("basic fibroblastgrowth factor")zur verstärktenBildung von Herzzellen und Fibroblasten, VEGF ("vascular endothelial growth factor"), DMSO und Isoproterenol,Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (FGF4), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF)zur verstärktenBildung von Herz- und Leberzellen, TGF-betal ("transforming growth factor betal") zur verstärkten Bildungvon Herzzellen, EGF ("epidermalgrowth factor")zur verstärktenBildung von Haut- und Herzzellen, KGF ("keratinocyte growth factor") (machmal zusammenmit Cortison) zur Bildung von Keratinozyten, Retinsäure zurverstärktenBildung von Nerven-, Herz- und Nierenzellen, beta-NGF ("beta nerve growthfactor") zur verstärkten Bildungvon Gehirn-, Leber-, Pankreas- und Nierenzellen, BMP-4 ("bone morphogenicprotein 4") undActivin-A zur Bildung mesodermaler Zellen generell, sind jedochnicht darauf beschränkt.
    [0028] DifferenzierteZellen, die aus den erfindungsgemäßen verwendeten Stammzellenerhältlichsind, umfassen Knochenzellen (Osteoblasten und Osteoclasten), Chondrozyten,Adipozyten, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten), Muskelzellen,Endothelzellen, Epithelzellen, hematopoetische Zellen, sensorische Zellen,endokrine und exokrine Drüsenzellen,Gliazellen, neuronale Zellen, Oligodendrozyten, Blutzellen, Darmzellen,Herz-, Lungen-, Leber-, Nieren- oder Pankreaszellen, sind jedochnicht darauf beschränkt.
    [0029] Gemäß einerbesonders bevorzugten Ausführungsformder Erfindung kann das differenzierte Wachstum von außen durchdie Einstellung stofflicher, mechanischer und/oder thermischer Wachstumsbedingungen beeinflusstwerden. Beispielsweise kann eine Temperierung des Wirts-Ei vorgesehensein, um ein Kultivieren entsprechend dem Bebrüten eines Vogeleis zu erreichen.Mechanische Wachstumsbedingungen umfassen bspw. eine Bewegung desWirts-Eis oder eine vorbestimmte geometrischen Ausrichtung im Gravitationsfeld. DieEinstellung stofflicher Wachstumsbedingungen umfasst vorzugsweisedie Injektion von mindestens einem Differenzierungs- und/oder Wachstumsfaktorin das Wirts-Ei.
    [0030] Wennwährendder Kultivierung des Zellmaterials mindestens eine Eigenschaft vondiesem gemessen wird, könnensich besondere Vorteile fürdie Überwachungund Beeinflussung des Wachstumsverlaufs ergeben. Vorzugsweise wirdmit der Messung erfasst, ob das kultivierte Zellmaterial noch lebt.Die Vitalitätsmessungumfasst bspw. eine NMR- oder Ultraschallmessung. Alternativ oderzusätzlichkann eine Erfassung eines Differenzierungsgrades des Zellmaterialsvorgesehen sein. Vorteilhafterweise können in Abhängigkeit vom Ergebnis der Messungdie Kultivierungsbedingungen verändertwerden.
    [0031] Gemäß einerweiteren Variante ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die Kultivierungdes Zellmaterials im Wirts-Ei abgebrochen wird, wenn ein vorbestimmterKultivierungszustand erreicht wurde. Durch diesen Abbruch können ggf.fehldifferenzierte oder unerwünschtwuchernde Zellmaterialien von einem weiteren Wachstum gehindertwerden. Die zum Abbruch der Kultivierung herangezogenen Kultivierungsbedingungen umfassenvorzugsweise die Kultivierungszeit, die erreichte Größe des kultiviertenMaterials und/oder den erreichten Differenzierungsgrad des kultiviertenZellmaterials.
    [0032] Gemäß einerweiteren Abwandlung kann vorgesehen sein, dass kultiviertes Zellmaterialaus dem Ei entnommen wird, ohne, dass die Eihülle beschädigt wird. Es kann beispielsweiselaufend differenziertes Zellmaterial aus dem Ei abgezogen werden.
    [0033] Erfindungsgemäß kann dasstammzellbasierte Zellmaterial an einer oder mehreren Positionenim Wirts-Ei angeordnet werden. Bevorzugt ist die Injektion des Zellmaterialan den Ort im Wirts-Ei, der der natürlichen Position der Keimscheibeim unbeeinflussten Ei entspricht. Diese Ausführungsform der Erfindung istbesonders vorteilhaft, da die Kultivierung unter geometrischen undstofflichen Bedingungen beginnt, die den natürlichen Brutbedingungen amnächstenkommen.
    [0034] Vorzugsweisewird das Zellmaterial in einer Kultivierungsblase im Wirts-Ei positioniert,die mindestens eine flüssigeoder gelförmigeKultivierungssubstanz enthält.Dies ermöglichtdie gezielte Vorgabe von stofflichen Kultivierungsbedingungen imWirts-Ei. Gemäß bevorzugtenVarianten der Erfindung kann die Kultivierungssubstanz in der Kultivierungsblaselaufend oder nach vorgebbaren Kultivierungsprotokollen in be stimmtenZeitabständen,z. B. periodisch ausgetauscht werden. Die Kultivierungssubstanzkann auch in der Umgebung des Zellmaterials am Ort des Nährstoffreservoirsdes Wirts-Ei angeordnet werden, indem das Nährstoffreservoir (insbesondereEidotter, Eiweiß)verdrängtoder zumindest teilweise ausgetauscht wird. Der Vorteil dieser Ausführungsformder Erfindung besteht darin, dass zwar die geometrischen Kultivierungsbedingungen imWirts-Ei unverändertbleiben, die stofflichen Kultivierungsbedingungen jedoch an dieAnforderungen des Donor-Organismus angepasst werden können. Auchim Nährstoffreservoirkann die Kultivierungssubstanz währendder Kultivierung des Zellmaterials laufend oder in vorgebbaren Zeitabständen erneuertoder ausgetauscht werden.
    [0035] Erfindungsgemäß kann vorgegebensein, dass das Eiweiß desWirts-Ei komplett durch die Kultivierungssubstanz ausgetauscht wird.Des Weiteren kann ein kompletter Austausch des Eidotter vorgesehensein, wobei jedoch die geometrische Anordnung beider Komponentenund die Eidotterumhüllungerhalten bleiben.
    [0036] Vorzugsweiseumfasst der Austausch ein Einbringen von Tropfen der Kultivierungssubstanzin das Nährstoffreservoirdes Wirts-Ei. Die flüssigenoder gelförmigenTropfen könneneine Membran-Umhüllungaufweisen, durch die Wirkstoffe, zum Beispiel Hormone oder Differenzierungsfaktorenin das Ei diffundieren können.Es ist zum Beispiel eine Lipid-Membran vorgesehen.
    [0037] Wenngemäß einerweiteren Ausführungsformder Erfindung währendder Kultivierung des Zellmaterials im Wirts-Ei bestimmte Stoff-und/oder Temperaturgradienten erzeugt werden, kann die Kultivierungdes Zellmaterials vorteilhafterweise nach vorgebbaren stofflichenund/oder geometrischen Kultivierungspro tokollen erfolgen. Ein besondererVorteil von natürlichenWirts-Eiern besteht darin, dass durch die Eihülle selbst bei der Bildungeiner Kalkschale sowohl ein stofflicher als auch ein thermischerEinfluss auf das Innere des Zellmaterials ausgeübt werden kann.
    [0038] Erfindungsgemäß ist esauch möglich,das Zellmaterial im Wirts-Ei in Anwesenheit von mindestens einemFeststoff zu kultivieren. Mit dem Feststoff können vorteilhafterweise geometrischeBegrenzungen fürdie Stammzellenkultivierung und -differenzierung vorgegeben werden.Wenn als Feststoff bspw. mindestens ein Trägerpartikel verwendet wird,kann dieser ein Substrat bilden, das während der Kultivierung umwachsenwird. Diese Anwendung der Erfindung ist für die Erzeugung von Implantatmaterialienvon Vorteil. Des Weiteren könnenauch Feststoffe zunächstmit einem Abstand vom Zellmaterial angeordnet werden, um bei dessenWachstum eine geometrische Begrenzung zu bilden. Derartige geometrischeGrenzen könnensogar in mm- bis cm-Bereicherzeugt werden. Hierzu werden bspw. Flüssigkeiten in das Wirts-Eiim flüssigenZustand (z. B. flüssigePolymere) eingebracht und dann lokal z. B. unter dem Einfluss vonWärme oderLicht ausgehärtet.
    [0039] Gemäß einemunabhängigenGesichtspunkt der Erfindung wird die o. g. Aufgabe stoffbezogendurch eine Zellkultur gelöst,die eine Zusammensetzung aus einem Wirts-Ei und mindestens einerStammzelle umfasst, die in dem Wirts-Ei angeordnet ist. Der Donor-Organismus,aus dem die adulte, pluripotente oder nicht-humane, embryonale Stammzellegewonnen wurde, ist nicht mit dem Wirts-Organismus identisch, aus demdas Wirts-Ei gewonnen wurde. Vorzugsweise gehören der Wirts-Organismus undder Donor-Organismus sogar unterschiedlichen taxonomischen Klassenan.
    [0040] Vorrichtungsbezogenwird die o. g. Aufgabe durch die Bereitstellung einer Zellkultureinrichtunggelöst, dieeine Inkubatoreinrichtung aufweist, die zur Aufnahme eines Ei voneinem Wirts-Organismus eingerichtet ist. Hierzu besitzt die Inkubatoreinrichtungeinen Inkubatorraumm, der größer alsdas Wirts-Ei ist. Vorzugsweise ist die innere Form des Inkubatorraumszumindest in Teilbereichen an die äußere Form des Wirts-Eis angepasst.Die erfindungsgemäße Zellkultureinrichtungbesitzt vorteilhafterweise eine besonders einfachen Aufbau, da lediglicheine Aufnahme fürdas Wirts-Ei mit dem zu kultivierenden Zellmaterial bereitgestelltwerden muss. Im Unterschied zu herkömmlichen Inkubatoreinrichtungenbenötigtdie erfindungsgemäße Zellkultureinrichtungkein gesondertes Kultivierungssubstrat, da dieses durch das in denInkubatorraum einsetzbare Wirts-Ei gebildet wird.
    [0041] Vorteilefür einebreite und flexible Anwendung der erfindungsgemäßen Zellkultureinrichtung ergeben sich,wenn diese mit einer Injektionseinrichtung zur Einführung vonLösungenoder Suspensionen in das Innere des Wirts-Eis, einer Temperiereinrichtungzur Temperierung des Inkubatorraumes, einer Befeuchtungseinrichtungzur Einstellung einer vorbestimmten Feuchte im Inkubatorraum, einerMesseinrichtung zur Erfassung von Eigenschaften des Wirts-Ei oderdes kultivierten Zellmaterials und/oder einer Antriebseinrichtungzur Bewegung des Wirts-Ei in der Inkubatoreinrichtung ausgestattetist. Die Injektionseinrichtung umfasst bspw. einen Zellinjektorzur Einführungvon Suspensionen aus Zellen oder Zellaggregaten, wie z. B. Zellkörpern. Der Zellinjektorbesitzt vorzugsweise eine starre Injektionsleitung, z. B. eine Injektionsnadelmit der im Wirts-Ei an vorbestimmten Positionen eine Ablage vonZellmaterial erfolgen kann. Zur Einführung von Wachstums- oder Differenzierungsfaktorenweist die Injektionseinrichtung des Weiteren einen Flüssigkeitsinjektorauf. Vorzugsweise werden der Zell- und Flüssigkeitsinjektor durch einegemeinsame Komponente gebildet.
    [0042] EinenunabhängigenGegenstand der Erfindung stellt die Verwendung eines Ei eines Wirts-Organismuszur Kultivierung von biologischen Zellen dar, die nicht vom Wirts-Organismusstammen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von einem Ei, insbesondereeinem Vogel- oder Fischei, als Inkubator für von außen in das Ei eingesetzte Stammzellen.
    [0043] Einebevorzugte Anwendung der Erfindung besteht in der Entwicklung gewebeähnlicheroder organähnlichermultizellulärerSysteme in vitro. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die multizellulären Systemedabei verschiedene Zellarten. Diese multizellulären Systeme können dannbeispielsweise transplantiert werden oder extrakorporal, z.B. zurBlutwäscheoder zur Produktion gewünschterSubstanzen, oder als pharmakologisches Gewebemodell eingesetzt werden.
    [0044] WeitereEinzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unterBezug auf die beigefügten Zeichnungenbeschrieben.
    [0045] 1 zeigtein Flussdiagramm zur Illustration von Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens.
    [0046] 2 zeigtschematisch die Übertragungvon Stammzellen in ein Vogelei.
    [0047] 3 zeigtEinzelschritte der Präparationvon Zellmaterial.
    [0048] 4 zeigtschematisch verschiedene Varianten der Übertragung von Zellmaterialin ein Vogelei.
    [0049] 5 zeigtEinzelschritte der Deposition von Zellmaterial im Wirts-Ei.
    [0050] 6 zeigtweitere Einzelheiten der Ablage von Zellmaterial und Zusatzstoffenin einem Vogelei.
    [0051] 7 zeigtEinzelschritte der Kultivierung von Zellmaterial im Wirts-Ei.
    [0052] 8 zeigtschematisch eine Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Kultivierungseinrichtung.
    [0053] 9 zeigtschematisch die Kultivierung der Stammzellen in Oberflächenkulturund in hängenden Tropfensowie die Bildung und weitere Kultivierung von organoiden Körpern.
    [0054] Beider folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindungwird auf die Kultivierung adulter, pluripotenter Stammzellen ineinem Wirts-Ei beispielhaft Bezug genommen. Die Erfindung ist analogbei der Kultivierung nicht-humaner, embryonaler Stammzellen anwendbar,wobei deren Gewinnung und ggf. Vorkultivierung zu embryoiden Körpern ansich bekannt sind und hier nicht beschrieben werden.
    [0055] Allgemeinumfasst das erfindungsgemäße Verfahrendie Einführungund Kultivierung von mindestens einer Stammzelle in ein Wirts-Eieines fremden Wirts-Organismus. Die Umsetzung dieses Verfahrenseinschließlichvon ggf. vorgesehenen Vorberei tungs- und Folgeschritten ist schematischin 1 illustriert, wobei weitere Einzelheiten untenerläutertsind.
    [0056] Zuersterfolgt bei Schritt 100 die Präparation des Zellmaterials,das mindestens eine Stammzelle umfasst und in das Wirts-Ei eingeführt werdensoll. Die Präparationumfasst die unten mit weiteren Einzelheiten beschriebene Isolationder Stammzellen aus dem Donor-Organismus und ggf. deren Vorkultivierungzu organoiden Körpernoder Gewebekörpern.Anschließendwird bei Schritt 200 das Zellmaterial im Wirts-Ei deponiert. Unmittelbarnach der Einführungund Deposition beginnt das Wachstum und die Differenzierung derStammzellen (Kultivierung bei Schritt 300). In Abhängigkeitvom Kultivierungsprotokoll könnensich bei Schritt 400 weitere Präparations- oder Bearbeitungsprozeduren anschließen.
    [0057] WeitereEinzelheiten der Schritte 100 bis 400 sind in 2 illustriert.Der Präparationsschritt 100 umfasstdie Isolation der Stammzellen 2 aus dem exokrinen Drüsengewebe,z. B. dem Pankreas 1 eines Säugetieres, z. B. einer Maus.Die Stammzellen 2 aus der Primärkultur können dann bei Schritt 200 indas Wirts-Ei eingeführtwerden. Alternativ ist es möglich,aus den Stammzellen 2 durch eine Vorkultivierung und Aggregationzunächstdie organoiden Körperoder Gewebekörper 3 zubilden, die dann in das Wirts-Ei eingeführt werden.
    [0058] DasWirts-Ei 4 ist bspw. ein Vogel-, Reptilien- oder Fischei,das eine Eizelle 41 und mindestens eine Eihülle 42 besitzt.Die Eizelle 41 umfasst Eidotter 43 und eine Keimscheibe 44.Im rechten Teil von 2 ist illustriert, dass zurerfindungsgemäßen Kultivierungdes stammzellbasierten Zellmaterials alternativ unbefruchtete Eier 4 oderbereits befruchtete Eier 4a verwendet werden können.
    [0059] In 3 sinddie verschiedenen Möglichkeitengezeigt, Stammzellen, organoide Körper oder Gewebekörper alsAusgangsmaterialien fürdie Kultivierung bereitzustellen. Zuerst ist bei Schritt 110 dieIsolierung der adulten, pluripotenten Stammzellen als einem Donor-Organismusvorgesehen. Gemäß der erstenVariante (a) erfolgt die Deposition 200 des Zellmaterials,in dem die primärgewonnenen Stammzellen in das Wirts-Ei eingeführt werden. Alternativ erfolgtals nächstesdie unten mit weiteren Einzelheiten beschriebene Kultivierung derisolierten Stammzellen im hängendenTropfen (Schritt 120, siehe 5) mit derAggregation zu den so genannten primären organoiden Körpern (Schritt 130).Gemäß Variante(b) könnendie primärenorganoiden Körperdirekt zur Kultivierung im Wirts-Ei deponiert (Schritt 200 in 1)werden. Gemäß einerweiteren Alternative erfolgt als nächstes die Ablage der primären organoidenKörperauf einem Substrat (Schritt 140) zur Schaffung einer Adhäsionskultur(siehe auch 4). Die Erfinder haben festgestellt,dass die in Suspensionskultur wachsenden primären organoiden Körper inAdhäsionskulturzu größeren Gewebekörpern wachsen oderneue organoide Körperbilden können.Auf dem Substrat folgt durch eine Zellwanderung die Bildung einer Monoschicht(Schritt 150) und aus dieser die Aggregation zu den sogenannten sekundärenorganoiden Körpern(Schritt 160). Diese könnengemäß Variante(c) wiederum direkt zur Kultivierung deponiert werden (Schritt 200)verwendet werden.
    [0060] DieVarianten (a) bis (c) sind auch in 4 illustriert.Das Wirts-Ei 4 ist z. B. ein Hühnerei mit einem Nährstoffreservoiraus Eidotter 43 und Eiweiß 45. Das Nährstoffreservoirist von einer Kalkschale 42.1 umgeben, die zusammen miteiner Eihaut 41.2 die Eihülle bildet. Auf der Grenzfläche zwischendem Eidotter 43 und dem Eiweiß 45 befindet sichdie Keimscheibe 44. Bei einem Vorbereitungsschritt wirddie Keim scheibe 44 aus dem Wirts-Ei 4 entfernt.Dies erfolgt mit mechanischen Mitteln bspw. durch Absaugen mit einerKanüle.Alternativ kann die Keimscheibe 44 durch den Zusatz einerchemischen Substanz (z. B. mit einem aus der Mikroskopie an sichbekannten Letal-Farbstoff oder Hydroxyharnstoff) oder durch eineradioaktive Bestrahlung (z. B, mit γ-Strahlen) deaktiviert werden.Anschließendwird im Wirts-Ei 4 am Ort der natürlichen Position der Keimscheibedas stammzellbasierte Zellmaterial deponiert. Gemäß Variante(a) werden einzelne Stammzellen 2 oder eine Vielzahl vonStammzellen 2 direkt aus der Primärkultur 21 in dasWirts-Ei 4 eingeführt.Die Positionierung erfolgt vorzugsweise unterhalb oder oberhalbder Vitellinmembran des Eidotter, ohne diese Membran zu zerstören. Wennzunächstdie Hängetropfenkultur 22 gebildetwird (Schritt 120 in 3), können Zellaggregateaus der Hängetropfenkultur 22 gemäß Variante(b) im Wirts-Ei 4 deponiert werden. Die Deposition der sekundären organoidenKörper 5,die in der Adhäsionskultur 23 gebildetwurden, ist bei Variante (c) illustriert. Wenn die primären organoidenKörperzu Gewebekörpern 6 wachsen,könnendiese ebenfalls aus der Adhäsionskultur 23 entnommenund in das Wirts-Ei 4 eingeführt werden. Die Gewebekörper 6 sinddurch ein Wachstum von organoiden Körpern in der Adhäsionskulturentstanden und besitzen einen charakteristischen Durchmesser voneinigen hundert Mikrometern bis zu einigen Millimetern.
    [0061] DiePräparationund Vorkultivierung von nicht-humanen, embryonalen Stammzellen undembryoiden Körpernerfolgt analog zu den illustrierten Varianten (a) bis (c).
    [0062] WeitereEinzelheiten des Depositionsschrittes 200 gemäß 1 sindbeispielhaft in 5 zusammengestellt. Nach derPräparationdes zu kultivierenden Zellmaterials wird zuerst bei Schritt 210 eineInjektionssuspension gebildet. Die In jektionssuspension umfasstdas Zellmaterial, z. B. eine Vielzahl von Stammzellen oder organoidenKörpern,und eine Trägerflüssigkeit.Die Trägerflüssigkeitist bspw. ein physiologische Nährlösung (z.B.: HEPES-Eagle-Medium, Inkubationsmedium DMEM oder dgl.). Bei Schritt 210 kanndie Verbindung des Zellmaterials mit Substraten oder Trägerpartikeln,z. B. Kunststoff- oder Glaskugeln vorgesehen sein, die als Feststoffmit dem Zellmaterial in das Wirts-Ei eingeführt werden sollen. Anschließend wirdbei Schritt 220 der Injektor (siehe 6) zur Einführung desZellmaterials positioniert. Der Injektor wird durch die Eihülle unddas Nährstoffreservoirbis zur gewünschtenAblageposition am Ort der Keimscheibe bewegt. Beispielsweise wirdeine Injektionsnadel mit einer Positioniereinrichtung relativ zumgewünschtenAblageort ausgerichtet und mit einer Antriebseinrichtung in dasWirts-Ei eingeführt.Die korrekte Positionierung des Injektors kann bspw. durch eineUltraschall-Messung geprüftwerden. Anschließendfolgt bei Schritt 230 die Injektion des Zellmaterials mitdem Injektor. In Abhängigkeitvon der Kultivierungsaufgabe könnenanschließendbei Schritt 240 weitere Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktorenin das Wirts-Ei in die unmittelbare Umgebung des injizierten Zellmaterialseingeführtwerden.
    [0063] 6 illustriertverschiedene Phasen der Vorbereitung und Beschickung des Wirts-Ei 4.Teilbild (a) zeigt das Ei 4 mit dem Eidotter 43,dem Eiweiß 45 undder Keimscheibe 44 innerhalb der Kalkschale 42.1.Beispielhaft sind ein Suspensionsinjektor 51 und ein Flüssigkeitsinjektor 52 gezeigt,die jeweils durch eine Kapillare oder Spritzennadel gebildet werdenund in einer Richtung entlang ihrer Längsausdehnung verfahrbar sind (sieheDoppelpfeil). Mit dem Suspensionsinjektor 51 kann zuerstdie Keimscheibe 44 entnommen werden. Anschließend wirdder Suspensionsinjektor 51 zur oben beschriebenen Ein führung desZellmaterials benutzt. Der Flüssigkeitsinjektor 52 dientbeispielsweise der Übertragungvon anderen, die Kultivierung des Zellmaterials beeinflussendenKomponenten, wie z. B. von Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren.Diese Komponenten könnenbei der Präparationdes Wirts-Ei 4 vor der Kultivierung und/oder während derKultivierung des Zellmaterials im Wirts-Ei 4 zugeführt werden.
    [0064] DieEntnahme und Einführungvon Zellen oder chemischen Substanzen erfolgt, indem mit der Spitze desInjektors in der Kalkschale 42.1 ein Loch gebildet wird.Die Bildung des Loches und weitere Betätigung der Injektoren erfolgtunter sterilen Bedingungen. Teilbild (b) der 7 zeigtden Ausschnitt im Inneren des Wirts-Ei 4, in dem mit demSuspensionsinjektor 51 an der Grenze zwischen dem Eidotter 43 unddem Eiweiß 45 amOrt der vorher entfernten Keimscheibe die Stammzellen 2 angeordnetwurden. Die Stammzellen 2 befinden sich in einer Kultivierungsblase 46,die durch die Suspensionsflüssigkeitgebildet wird und ggf. Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktorenenthält.
    [0065] InTeilbild (c) ist die Versorgung der Kultivierungsblase 46 gezeigt.Erfindungsgemäß können während derKultivierung von der Kultivierungsblase 46 eine oder mehrereFlüssigkeitsleitungen 53 nachaußenführen (siehe 8),um Kultivierungsmedium zuzuführenoder Stoffwechselprodukte abzuführen.Die Flüssigkeitsleitungen 53 werdendurch eine Öffnungin der Kalkschale 42.1 geführt, die mit einer Dichtung 54 verschlossen ist.Die Dichtung 54 besteht bspw. aus Paraffin oder einem anderenplastisch verformbaren Polymer.
    [0066] Über dieFlüssigkeitsleitungen 53 kanndurch die Kultivierungsblase 46 eine Lösungsdurchströmung bereitgestelltwerden, mit der bspw. das Volumen der Kultivierungsblase ent sprechendvorgebbaren Kultivierungsprozeduren verringert oder vergrößert werdenkann. Des Weiteren können über dieFlüssigkeitsleitungen 53 veränderte Kultivierungslösungen,z. B. mit wechselnden Zusätzen(z. B. Hormone, Differenzierungsfaktoren) eingespült oderweitere biologische Zellen, wie z. B. Stammzellen oder vordifferenzierteZellen eingeführt werden.Entsprechend ist auch die Entnahme von kultiviertem Zellmaterialaus der Kultivierungsblase 46 möglich.
    [0067] 7 illustriertweitere Einzelheiten des Schrittes 300 der Kultivierungdes Zellmaterials (siehe 1). Nach der Ablage des Zellmaterialsbei Schritt 200 erfolgt die Einstellung von Kultivierungsbedingungenim Wirts-Ei 4, falls dies nicht bereits im Rahmen einerVorbereitung des Wirts-Ei erfolgt ist. Die Kultivierungsbedingungenwerden möglichstphysiologisch oder naturnah gewählt.So wird bspw. eine Kultivierungstemperatur entsprechend der typischenKörpertemperaturdes Donor-Organismus gewählt.Des Weiteren kann eine Bewegung des Wirts-Ei vorgesehen sein, dieder von Vögelnpraktizierten Umwälzbewegungan bebrütetenEiern entspricht.
    [0068] BeiSchritt 320 ist mindestens eine Messung am Wirts-Ei 4 und/oderdem kultivierten Zellmaterial vorgesehen, um den Fortgang der Kultivierungoder das Erreichen eines bestimmten Kultivierungszustandes festzustellen.Das Messergebnis wird mit einem vorgegebenen Kultivierungsprotokollverglichen. In Abhängigkeit vomVergleich wird die Kultivierung ggf. beendet (Schritt 330).Alternativ wird die Kultivierung unter den gegebenen Bedingungenoder unter verändertenKultivierungsbedingungen (Rücksprungzu Schritt 310) fortgesetzt. Schließlich erfolgt nach Beendigungder Kultivierung eine Abtrennung der kultivierten Zellen vom Wirts-Eibei Schritt 240.
    [0069] 8 zeigtein Ausführungsbeispieleiner erfindungsgemäßen Zellkultureinrichtung.Die Zellkultureinrichtung umfasst eine Inkubatoreinrichtung 30 miteinem Bodenteil 31 und einem Deckelteil 32, dieim zusammengesetzten Zustand einen Inkubatorraum 33 zurAufnahme des Wirts-Ei 4 bilden. Die Boden- und Deckelteile 31, 32 besitzenmehrere Funktionen. Neben der Formung des Inkubatorraums 33 dienensie auch der Temperierung und ggf. dem Stoffaustausch. Die Boden-und Deckelteile 31, 32 bilden eine Temperierungseinrichtungund/oder Befeuchtungseinrichtung. Hierzu sind die Boden- und Deckelteile 31, 32 jeweilshohle Bauteile, die mit Temperierungs- und/oder Versorgungsflüssigkeiten(oder entsprechenden Gasen) gefülltoder von diesen durchströmtwerden können.Zur Erzielung des Stoffaustausches besitzen die Boden- und Deckelteile 31, 32 anden zum Inkubatorraum 33 weisenden Seiten zumindest inTeilbereichen eine semipermeable Wand, durch die Substanzen in dasWirts-Ei diffundieren können.
    [0070] DieZellkultureinrichtung ist des Weiteren mit einer Antriebseinrichtung 60 ausgestattet,mit der die Inkubatoreinrichtung 20 in allen Raumrichtungenverschwenkbar ist (siehe Koordinatensystem). Die Antriebseinrichtung 60 umfasstbspw. einen aus der Labortechnik bekannten Schwenkantrieb und/oderDrehteller-Antriebe.
    [0071] DieZellkultureinrichtung enthältweitere Komponenten, die die Injektionseinrichtung 50 bilden.Teile der Injektionseinrichtung 50, die einzeln oder gemeinsamvorgesehen sein können,umfassen den Suspensionsinjektor 51, einen Flüssigkeitsinjektor 52 undeinen Gasinjektor 55. Die Flüssigkeits- und Gasinjektoren 52, 55 umfassenFlüssigkeits-und Gasleitungen, die durch einen Teilbereich des Wirts-Ei 4 geführt werdenund zumindest in diesem Teilbereich eine semipermeable Wand besitzen.Dadurch könnendurch Diffusion Substanzen mit dem Flüssigkeitsinjektor 52 bspw.in das Eiweiß odermit dem Gasinjektor 55 in die Gasblase des Wirts-Ei 4 eingeführt werden.Das Bezugszeichen 56 verweist allgemein auf eine Positionier-und Antriebseinrichtung fürden Suspensionsinjektor 51. Die Positionier- und Antriebseinrichtungenthältzum Beispiel einen piezoelektrischen Antrieb.
    [0072] DasBezugszeichen 70 verweist allgemein auf eine berührungslosoder in Kontakt mit dem Wirts-Ei arbeitende Messeinrichtung. DieMesseinrichtung 70 zum berührungslosen Betrieb ist bspw.eine NMR-Messeinrichtung oder eine Ultraschallmesseinrichtung. Für den Kontaktbetriebist die Messeinrichtung 70 mit einer Sonde 71 ausgestattet,mit der lokal Messungen im Wirts-Ei 4 z. B. am kultiviertenZellmaterial durchgeführt werdenkönnen.Die Sonde 71 kann bspw. für Temperaturmessungen, elektrischeMessungen oder optische Messungen (z. B. Fluoreszenzmessungen) gerichtetsein.
    [0073] 8 zeigtillustriert die Kultivierung des Zellmaterials in einer Kultivierungsblase 46 ober-oder unterhalb der Membran 47 zwischen Eidotter und Eiweiß. Die alternativmöglicheKultivierung ohne eine Kultivierungsblase ist ebenfalls gezeigt.Das Bezugszeichen 48 verweist auf Tropfen mit einer Kultivierungssubstanz, dievon außenin das Eiweiß eingebrachtwurden.
    [0074] Inden folgenden, nicht-beschränkendenBeispielen wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.
    [0075] Dieallgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierungvon tierischen Zellen und insbesondere von Säugetierzellen gebräuchlichsind, sind zu beachten. Eine steri le Umgebung, in der das Verfahrendurchgeführtwerden soll, ist – auchwenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt – in jedem Fall einzuhalten.Folgende Puffer und Medien wurden verwendet:
    [0076] StattfötalemKalbserum (FKS) im Nährmediumund Differenzierungsmedium kann gegebenenfalls auch Eigenplasmaoder, weniger bevorzugt, Eigenserum des Gewebedonors verwendet werden.
    [0077] Diesist insbesondere dann von Bedeutung, wenn der Gewebedonor mit demspäterenEmpfängerder Stammzellen oder davon abgeleiteten differenzierten Zellen identischist. Eine solche autologe Behandlung ist zur Verhinderung einereventuellen Abstoßungsreaktionbevorzugt.
    [0078] DasNährmediumkann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch einanderes für dieKultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen,bekanntes, geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenziertenZellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren. AuchIsolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können einanderes üblichesund geeignetes Basismedium enthalten.
    [0079] Diefolgenden Beispiele 1 und 2 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokollezur Isolierung und Kultivierung adulter pluripotenter Stammzellenaus acinäremGewebe des Pankreas. Beispiel 3 beschreibt ein entsprechendes Protokollfür dieIsolierung aus acinäremund tubulösemGewebe der Speicheldrüse.
    [0080] Inden Ductus pancreaticus von 2–3Jahre alten Ratten werden mittels einer Spritze und einer stumpfenKanülebei der Ratte 10 ml Digestionsmedium langsam und luftblasenfreiinjiziert. Das gesamte Pankreas wird dadurch aufgeblasen und kannso besser herauspräpariertwerden. Das Pankreas wird dann in ein Becherglas überführt undweitere 5 ml Digestionsmedium dazugegeben. Nachdem man das Fettgewebeund Lymphknoten entfernt hat, wird das Gewebe im Becherglas miteiner feinen Schere sehr fein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebeabgesaugt und die Suspension wird abschließend 1 min mit Carbogen begast (wennnötig wiederholen)und für20 min bei 37°Cmit Alufolie bedeckt in einem Schüttler bei 200 Zyklen/min inkubiert.Danach saugt man das Medium vorsichtig ab, zerkleinert erneut miteiner Schere das Gewebe und wäschtdie Gewebestückezweimal mit je 10 ml Isolationsmedium und gibt wieder 5 ml Digestionsmediumzum Gewebe hinzu.
    [0081] Nacherneutem Begasen mit Carbogen füretwa 1 min und Inkubation für15 min bei 37°Cin einem Schüttlerbei 200 Zyklen/min werden die Gewebestücke durch sukzessives Aufziehenin jeweils einer 10 ml, 5 ml, 2 ml und 1 ml Glaspipette zerkleinertund durch einlagiges Filtergewebe gepresst. Die so vereinzeltenZellen werden nun fünfmalin Inkubationsmedium gewaschen (37°C), mit Carbogen begast undjedes Mal 5 min bei 90 g zentrifugiert. Das zuletzt erhaltene Pelletwird in Inkubationsmedium resuspendiert, begast und auf Gewebekulturschalenverteilt.
    [0082] DieGewebekulturschalen mit den isolierten Zellen werden im Brutschrankbei 37°Cund 5% CO2 kultiviert. Alle 2–3 Tagewird das Medium gewechselt. Dabei werden alle erkennbaren differenziertenZellen entfernt.
    [0083] Amsiebenten Tag in Kultur werden die Zellen mit einer Lösung bestehendaus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin und 2 ml Inkubationsmedium passagiert.Dabei lösensich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wird5 Minuten zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf eine mittlere Zellkulturfla sche überführt und 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben. Der Medienwechsel erfolgt alle drei Tage.
    [0084] Amvierzehnten Tag in Kultur werden die Zellen erneut, aber diesmalmit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert.Die Zellsuspension wird 5 Minuten zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0085] DieZellen werden weiter kultiviert und so oft passagiert und ausgesät, bis dieZellen einen semikonfluenten bis konfluenten Zustand erreichen.In diesem Zustand erfolgt die erfindungsgemäße Einführung und weitere Kultivierungim Wirts-Ei.
    [0086] Pankreas-Aciniwurden von männlichenSprague-Dawley-Ratten (20–300g) erhalten, die narkotisiert (CO2) und über diedorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Eine Kanüle wurde transduodenal in denPankreasgang eingeführtund dem Pankreas wurde von hinten 10 ml Digestionsmedium, enthaltendHEPES-Eagle-Medium(pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol./Vol.) modifiziertesEagle-Medium, 0,5% (Vol./Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland),1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl2 undKollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) injiziert.
    [0087] Vorder Entfernung wurde der Pankreas von anhaftendem Festgewebe, Lymphknotenund Blutgefäßen teilweisebefreit. Dann wurde gesundes Pankreasgewebe in Digestionsmediumabgeholt (bei 20°C,geringerer Stoffwechsel), das Pankreasgewebe mit einer Schere sehrfein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebe abgesaugt und dieGewebesuspension mit Carbogen (Messer, Krefeld, Deutschland) begast,ohne dass die Düsein das Medium mit den Zellen gelangt (Verringerung von mechanischemStreß)und damit auf pH 7,4 eingestellt. Danach wurde die Suspension ineinem 25-ml-Erlenmeyerkolben (mit Alufolie bedeckt) unter konstantemSchütteln(150–200Zyklen pro Minute) bei 37°Cin 10 ml Digestionsmedium inkubiert. Nach 15–20 Minuten wurde das obenschwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneutzerkleinert und mit Medium ohne Kollagenase gespült (Vorgang mindestens zweimalwiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparent),worauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute langmit Carbogen begast wurde. Es folgte wiederum eine Digestion mitKollagenase für15 Minuten bei 37°Cim Schüttlerunter Verwendung desselben Puffers. Nach der Digestion wurden dieAcini durch sukzessives Hochziehen und Ausstossen durch 10 ml-,5 ml- und 2 ml-Glaspipetten mit engen Öffnungen dissoziiert und durchein einlagiges Nylonsieb (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Schweiz) mit einer Maschengröße von etwa250 μm filtriert.Die Acini wurden zentrifugiert (bei 37°C und 600–800 UpM in einer Beckman-GPR-Zentrifuge, entsprichtetwa 50–100g) und weiter gereinigt durch Waschen in Inkubationsmedium, enthaltend24,5 mM HEPES (pH 7,5), 96 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2,2,5 mM NaH2PO4,0, mM CaCl2, 11,5 mM Glucose, 5 mM Natriumpyruvat,5 mM Natriumglutamat, 5 mM Natriumfumarat, 1% (Vol./Vol.) modifiziertesEagle-Medium, 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, mit Carbogen äquilibriertund auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen,Resuspension) wurde fünfmalwiederholt. Soweit nicht anders angegeben, wird bei der obigen Isolierungbei etwa 20°Cgearbeitet.
    [0088] DieAcini wurden in Inkubationsmedium resuspendiert und bei 37°C in einerangefeuchten Atmosphäremit 5% CO2 kultiviert. Das acinäre Gewebestarb dabei schnell (innerhalb von zwei Tagen) ab und die sterbendendifferenzierten Zellen löstensich dabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen (schonendeIsolierung), die nicht absterbenden Stammzellen sanken zu Bodenund hefteten sich an. Die differenzierten Acinizellen sind dazunicht in der Lage. Das Inkubationsmedium wurde am zweiten oder drittenTag nach dem Aussäenerstmals gewechselt, wobei ein Großteil der frei schwimmendenAcini und acinärenZellen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die erstenStammzellen bzw. deren Vorläuferam Boden festgesetzt und begannen sich zu teilen. Der Mediumwechselwurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierteacinärePankreaszellen wurden bei jedem Mediumwechsel entfernt.
    [0089] Amsiebenten Tag in Kultur wurden die Zellen mit einer Lösung bestehendaus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin (+0,05% EDTA) und 2 ml Inkubationsmediumpassagiert. Dabei lösensich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wurde5 Minuten bei etwa 1000 UpM (Beckmann GPR-Zentrifuge) zentrifugiert,der Überstandabgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0090] Amvierzehnten Tag in Kultur wurden die Zellen erneut, aber diesmalmit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin/EDTA und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert.Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0091] AmTag 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 mittlereZellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt12 mittlere Zellkulturflaschen. Spätes tens jetzt waren alle primären Zellenbis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt.
    [0092] DieStammzellen könnenweiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht. DasAussäenerfolgt vorzugsweise jeweils in einer Dichte von 2–4 × 105 Zellen/cm2 in Inkubationsmedium.In diesem Zustand erfolgt wiederum die erfindungsgemäße Einführung undweitere Kultivierung im Wirts-Ei.
    [0093] DieIsolierung und Kultivierung aus exokrinem Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgteanalog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen: 1. Das exokrine Gewebe der Ohrspeicheldrüse war eineMischung von acinäremGewebe und tubulösem Gewebe. 2. Nachdem Speicheldrüsenweniger Proteasen und Amylasen als Pankreas enthalten, ist es möglich, das Speicheldrüsengewebevor der Aufarbeitung einige Zeit im Kühlschrank bei etwa 4°C aufzubewahren,ohne dass das Gewebe zu sehr geschädigt wird. Im konkreten Beispielsfallbetrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligenFolgen fürdie Isolierung der gewünschtenStammzellen mit sich.
    [0094] Entsprechenddem in 9 dargestellten Schema wird zur Gewinnung derStammzellen 2 acinäres Gewebe – bevorzugtder Ohrspeicheldrüseoder Bauchspeicheldrüse(Pankreas) – mechanischund enzymatisch zerkleinert in Kultur genommen (Schritt 10 in 9).Entgegen den Angaben von Bachem et al., Gastroenterol. 115: 421–432 (1998),und Grosfils et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 79: 99–115 (1993), werdenkeine Gewebeblöckekultiviert, aus denen Zellen auswachsen sollen, sondern unter derBedingung, dass die Zellverbändeder Acini weitestgehend intakt bleiben, das Gewebe stärker zerkleinert.
    [0095] Über mehrereWochen werden diese Zellen und Zellverbände in Kulturgefäßen kultiviert.Alle 2–3Tage wird das Medium gewechselt, wobei alle differenzierten Zellenentfernt werden. Bei den in Kultur persistierenden Zellen handeltes sich um undifferenzierte Zellen mit uneingeschränkter Teilungsfähigkeit.
    [0096] Ineinem zweiten Schritt 12 werden ungefähr 400 bis 800 Zellen in je20 μl Mediumin hängendenTropfen kultiviert. Dazu werden die Tropfen auf Deckel von bakteriologischenPetrischalen gegeben, umgedreht und über die mit Medium gefüllte Petrischalegelegt, sodass die Tropfen nach unten hängen.
    [0097] Durchdiese Art der Kultivierung bilden sich innerhalb von 48 h die als "organoid bodies" oder organoide Körper bezeichneteZellaggregate 14, die fürungefähr6 Tage in eine Suspensionskultur umgesetzt werden 16. Die Teilansicht 18 aus 9 zeigteine mikroskopische Aufnahme eines solchen organoiden Körpers.
    [0098] Diein Suspensionskultur wachsenden organoiden Körper bilden neue organoideKörper,die auch bei Einzelzellen die Bildung von neuen organoide Körper induzieren.Die Zellen sind sowohl als organoide Körper als auch als Einzelzelleneinfrierbar und behalten dabei ihre Vitalität und ihr Differenzierungspotenzial.
    [0099] Diefolgenden Beispiele 5 und 6 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokollezur Herstellung von organoiden Körpernund differenzierten Zellen.
    [0100] Dieundifferenzierten Zellen werden mit einer Lösung aus 10 ml PBS, 4 ml Trypsin,8 ml Differenzierungsmedium abtrypsiniert und 5 Minuten abzentrifugiert.Das resultierende Pellet wird so in Differenzierungsmedium resuspendiert,dass sich eine Verdünnungvon 3000 Zellen je 100 μlMedium einstellt. Anschließend werdendie Zellen nochmals gut mit einer 3 ml Pipette suspendiert.
    [0101] Vonbakteriologischen Petrischalen, die vorher mit jeweils 15 ml PBS(37°C) proPlatte beschichtet worden sind, wird der Deckel abgenommen und umgedreht.Mit Hilfe einer automatischen Pipette werden auf einen Deckel ca.fünfzig20 μl Tropfengegeben. Der Deckel wird dann schnell umgedreht und auf die mitDifferenzierungsmedium gefülltePetrischale gegeben, sodass die Tropfen nach unten hängen. DiePetrischalen werden anschließendvorsichtig in den Brutschrank gestellt und für 48 h inkubiert.
    [0102] Daraufhinwerden die in den hängendenTropfen aggregierten Zellen (organoide Körper) aus jeweils vier Deckelnin je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmediummit 20% FKS überführt und für weitere96 h kultiviert.
    [0103] Dieorganoiden Körperwerden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt, und in mit0,1% Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. Ineiner besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens verwendetman als Kulturgefäß mit 0,1%Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen, in die 4 ml Differenzierungsmediumvorgelegt wurde und die anschließend mit je 6 organoiden Körper beschickt werden.Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß sind mit 0,1% Gelatine beschichteteChamber Slides, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurdeund die anschließendmit je 3–8organoiden Körperbeschickt werden. Daneben könnenauch 24-Mulden-Mikrotiterplatten verwendet werden, die mit 0,1%Gelatine beschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmediumvorgelegt wurde und anschließendmit je 4 organoiden Körperbeschickt werden.
    [0104] Derartkultiviert, ist die Differenzierungsfähigkeit der Zellen in den organoidenKörperaktiviert und die Zellen differenzieren sich in Zellen der dreiKeimblätterMesoderm, Entoderm und Ektoderm. Die Zellen können sowohl als organoide Körper alsauch als einzelne Zellen gelagert und kultiviert werden und behaltenihre Pluripotenz.
    [0105] DieDifferenzierung kann als Vordifferenzierung außerhalb des Wirts-Ei erfolgenoder durch den Zusatz der genannten Differenzierungsfaktoren beider Kultivierung im Wirts-Ei aktiviert werden. Es wurden bisheru.a. glatte Muskelzellen, Neuronen, Gliazellen, Epithelzellen, Fettzellen,Herzzellen, Nierenzellen, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten),Chondrozyten, endokrine und exokrine Drüsenzellen und damit Zelltypenaller drei Keimblätternachgewiesen.
    [0106] Für die Kultivierungim Wirts-Ei wurden vorzugsweise Stammzellen nach dem 42. Tag derKultivierung verwendet. Die Verwendung von Stammzellen nach der3. oder 4. Passage oder von Zellen, die bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff12–18Monate lang gelagert worden waren, war ebenfalls problemlos möglich.
    [0107] Zunächst wurdendie Zellen in Differenzierungsmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung überführt undauf eine Dichte von etwa 3 × 104 Zellen/ml eingestellt; z.B. durch Trypsinbehandlungeiner Stammzellkultur in Nährmedium,5-minütige Zentrifugationbei 1000 UpM und Resuspendierung des Pellets in Differenzierungsmediumund Verdünnungsoweit erforderlich.
    [0108] Anschließend wurdenmit einer 20-μl-Pipetteca. 50 20-μl-Tropfen (600 Zellen/20 μl) auf dieInnenseite des Deckels einer bakteriologischen Petrischale gegeben(gestopfte Spitzen) und die Deckel vorsichtig auf die mit PBS gefüllten Petrischalengestülpt,sodass die Tropfen nach unten hängen.Für jedenDeckel wurde eine neue Spitze verwendet. Die Petrischalen wurdenanschließendvorsichtig in den Brutschrank gestellt und 48 h lang bei 37°C inkubiert.
    [0109] Danachwurden die in den hängendenTropfen aggregierten Zellen, die organoiden Körper, aus jeweils vier Deckelnin je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmediummit 20% FKS überführt (Deckelschräghalten und die OBs mit etwa 2,5 ml Nährmedium abspülen) undfür weitere5–9 Tage,vorzugsweise 96 h, kultiviert.
    [0110] Dieorganoiden Körperwurden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt und in mit0,1% Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. DieOB vermehrten sich nun und wuchsen in zum Teil einzelnen Zellkolonien,die wieder vermehrt, vereinzelt und vermehrt werden konnten. Ineiner besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurdenals Kulturgefäß mit 0,1%Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen verwendet, in die 4 ml Differenzierungsmediumvorgelegt worden war, und diese mit je 6 organoide Körper beschickt.Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß waren mit 0,1% Gelatine beschichtete ChamberSlides, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und dieanschließendmit je 3–8organoiden Körperbeschickt wurden, und Thermanox-Platten (Nalge Nonc International,USA) fürelektronenmikroskopische Studien. Ein weitere Alternative waren24-Mulden-Mikrotiterplatten, die mit 0,1% Gelatine beschichtet wurdenund in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegtwurde und die anschließend mitje 4 organoiden Körperbeschickt wurden.
    [0111] Anschließend wurdendie organoiden Körperoder Gewebekörperim Differenzierungsmedium suspendiert. Im suspendierten Zustanderfolgt die Übertragungin ein Hühnerei.Hierzu wurde eine ausgezogene, hydrophobierte Glaskapillare verwendet.Dabei wurde ein Suspensionsvolumen eingestellt, das rd. 2- bis 20-fach größer alsdas Zellmaterialvolumen ist. Die weitere Kultivierung im Hühnerei erfolgtemit einer Begasung mit einem Luft-CO2-Gemisch(CO2-Gehalt: 5%).
    [0112] ZurIsolierung und Kultivierung von humanen adulten Stammzellen wurdehumanes Gewebe von erwachsenen Patienten unmittelbar nach einemchirurgischen Eingriff erhalten und sofort aufgearbeitet. Aus demchirurgisch entfernten Gewebe, z.B. Pankreas- oder Speicheldrüsengewebe,wurde gesundes Gewebe abgetrennt und in Digestionsmedium aufgenommen.Dieses Gewebe wurde dann analog dem für die Ratte beschriebenen Protokollaufgearbeitet und die Stammzellen in analoger Weise isoliert undkultiviert.
    [0113] Beider Einführungvon Zellmaterial, das von Fischen einer ersten Art stammt, in Fischeiereiner anderen Art, wird beispielsweise von Stammzellen ausgegangen,die aus der Pankreas von Aalen gewonnen wurden. Diese Stammzellenwerden nach den oben beschriebenen Techniken in Eier von Forellenoder Karpfen implantiert und dort kultiviert. Im Ergebnis können Aaleausgebrütetwerden, was im Rahmen von Zuchtverfahren bisher nicht möglich war,da Aale nur in der Tiefsee laichen.
    [0114] Diein der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbartenMerkmale der Erfindung könnensowohl einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindungin ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
    权利要求:
    Claims (53)
    [1] Verfahren zum Kultivieren von Stammzellen (2, 3, 5),umfassend die Schritte: – Einführung vonZellmaterial, das mindestens eine Stammzelle (2, 3, 5)eines Donor-Organismus umfasst, in ein Wirts-Ei (4) miteinem Nährstoffreservoir,und – Kultivierungdes Zellmaterials im Wirts-Ei (4).
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Zellmaterialin ein Wirts-Ei (4) eingeführt wird, das nicht aus einemSäugerorganismusstammt.
    [3] Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Zellmaterialin ein Wirts-Ei (4) eines Organismus eingeführt wird,der aus der Gruppe ausgewähltist, die die Klassen Vögel,Fische, Amphibien, Reptilien und Insekten umfasst.
    [4] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem das Zellmaterial in ein unbefruchtetes Wirts-Ei (4)eingeführtwird.
    [5] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche1 bis 3, bei dem das Zellmaterial in ein befruchtetes Wirts-Ei (4)eingeführtwird.
    [6] Verfahren nach Anspruch 5, bei dem vor der Einführung desZellmaterials eine Keimscheibe aus dem Wirts-Ei (4) entferntoder deaktiviert wird.
    [7] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die mindestens eine Stammzelle (2) eine adulteStammzelle ist.
    [8] Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die adulte Stammzelleaus einer exokrinen Drüse(1) des Donor-Organismus stammt.
    [9] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis6, bei dem die mindestens eine Stammzelle (2) eine nicht-humane,embryonale Stammzelle des Donor-Organismus ist.
    [10] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem das in das Wirts-Ei (4) eingeführte Zellmaterial mindestensein Aggregat (3, 5) von Stammzellen umfasst, daseinen Zellkörperbildet.
    [11] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Kultivierung ein differenziertes Wachstum des Zellmaterialsumfasst.
    [12] Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das differenzierteWachstum des Zellmaterials durch stoffliche, mechanische oder thermischeWachstumsbedingungen beeinflusst wird.
    [13] Verfahren nach Anspruch 12, bei dem eine Injektioneiner Kultivierungssubstanz mit mindestens einem Differenzierungsfaktorund/oder mindestens einem Wachstumsfaktor in das Wirts-Ei (4)vorgesehen ist.
    [14] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem währendder Kultivierung eine Messung mindestens einer Eigenschaft des Zellmaterialsvorgesehen ist.
    [15] Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die gemesseneEigenschaft füreinen Vitalitätszustanddes Zellmaterials charakteristisch ist.
    [16] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Kultivierung des Zellmaterials in das Wirts-Ei (4)beendet wird, wenn ein vorbestimmter Kultivierungszustand erreichtist.
    [17] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem der Kultivierungszustand eine Kultivierungsdauer, eine Größe und/odereinen Differenzierungsgrad des kultivierten Zellmaterials umfasst.
    [18] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem das Zellmaterial im Wirts-Ei (4) an einer Positionangeordnet wird, die im Wirts-Ei (4) der Position der Keimscheibeentspricht.
    [19] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem das Zellmaterial im Wirts-Ei (4) in einer Kultivierungsblase(46) angeordnet wird, die eine Kultivierungssubstanz enthält.
    [20] Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Kultivierungssubstanzin der Kultivierungsblase (46) während der Kultivierung desZellmaterials im Wirts-Ei (4) kontinuierlich oder nachvorbestimmten Zeitabständen wiederholtausgetauscht wird.
    [21] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem das Zellmaterial in ein Wirts-Ei (4) eingeführt wird,dessen natürlichesNährstoffreservoirzumindest teilweise durch eine Kultivierungssubstanz ausgetauschtist.
    [22] Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Austauschwährendder Kultivierung des Zellmaterials im Wirts-Ei (4) erfolgt.
    [23] Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, bei dem derAustausch durch Einbringen von Tropfen der Kultivierungssubstanzin das Nährstoffreservoirdes Wirts-Ei (4) erfolgt.
    [24] Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Tropfenin einem membranumhülltenZustand in das Wirts-Ei (4) eingeführt werden.
    [25] Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, bei dem Eiweiß (45)und/oder Eidotter (43) des Wirts-Ei (4) komplettdurch die Kultivierungssubstanz ersetzt wird.
    [26] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem währendder Kultivierung des Zellmaterials im Wirts-Ei (4) einStoff- und/oder Temperaturgradient erzeugt wird.
    [27] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem mit mindestens einem Feststoff geometrische Randbedingungenfür dieKultivierung des Zellmaterials vorgegeben werden.
    [28] Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Feststoffdurch einen Trägerpartikelgebildet wird, der währendder Kultivierung ein Substrat fürdie Stammzellen bildet.
    [29] Verfahren nach Anspruch 28, bei dem das Zellmaterialim Verbund mit dem Trägerpartikelin das Wirts-Ei (4) eingeführt wird.
    [30] Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Feststoffdurch eine im Wirts-Ei (4) ausgehärtete Substanz gebildet wird.
    [31] Zellkultur, die umfasst: – ein Wirts-Ei (4)mit einem Nährstoffreservoir,und – Zellmaterial,das mindestens eine Stammzelle eines Donor-Organismus umfasst und im Wirts-Ei (4)angeordnet ist.
    [32] Zellkultur nach Anspruch 31, bei der das Zellmaterialnicht aus einem Säugerorganismusstammt.
    [33] Zellkultur nach Anspruch 32, bei der das Zellmaterialaus einem Organismus stammt, der aus der Gruppe ausgewählt ist,die die Klassen Vögel,Fische, Reptilien und Insekten umfasst.
    [34] Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 21, bei der dasWirts-Ei (4) ein unbefruchtetes Wirts-Ei (4) ist.
    [35] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 33, bei der dasWirts-Ei (4) eine deaktivierte Keimscheibe oder keine Keimscheibeenthält.
    [36] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 35, bei der diemindestens eine Stammzelle (2) eine adulte Stammzelle ist.
    [37] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 35, bei der diemindestens eine Stammzelle eine nicht-humane, embryonale Stammzelledes Donor-Organismus ist.
    [38] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 37, bei der dasZellmaterial mindestens ein Aggregat (3, 5) vonStammzellen umfasst, das einen Zellkörper bildet.
    [39] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 37, bei der im Wirts-Ei(4) eine Kultivierungssubstanz mit mindestens einem Differenzierungsfaktorund/oder mindestens einem Wachstumsfaktor angeordnet ist.
    [40] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 39, bei der dasWirts-Ei (4) eine Kultivierungsblase (46) mit einerKultivierungssubstanz enthält,in der das Zellmaterial angeordnet ist.
    [41] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 40, bei der mindestensein Teil des Nährstoffreservoirs durcheine von außenin das Wirts-Ei (4) eingeführte Kultivierungssubstanzgebildet wird.
    [42] Zellkultur nach einem der Ansprüche 31 bis 41, bei der dasWirts-Ei (4) mindestens einen Feststoff zur Vorgabe geometrischerRandbedingungen fürdie Kultivierung des Zellmaterials enthält.
    [43] Zellkultur nach Anspruch 42, bei der der mindestenseine Feststoff mindestens einen Trägerpartikel und/oder mindestenseine im Wirts-Ei (4) ausgehärtete Substanz umfasst.
    [44] Zellkultureinrichtung, die umfasst: – eine Inkubatoreinrichtung(30) mit einem Inkubatorraum (33), der zur Aufnahmeeines Wirts-Ei (4) mit einem natürlichen Nährstoffreservoir eingerichtetist.
    [45] Zellkultureinrichtung nach Anspruch 44, die eineInjektionseinrichtung (50) zur Einführung von flüssigen odergasförmigenStoffen in das Wirts-Ei (4) aufweist.
    [46] Zellkultureinrichtung nach Anspruch 45, bei derdie eine Injektionseinrichtung einen Suspensionsinjektor (51)aufweist.
    [47] Zellkultureinrichtung nach Anspruch 45 oder 46,bei der die Injektionseinrichtung einen Flüssigkeitsinjektor (52)und/oder einen Gasinjektor (55) aufweist.
    [48] Zellkultureinrichtung nach einem der Ansprüche 44 bis47, die eine Temperierungseinrichtung und/oder Befeuchtungseinrichtung(31, 32) aufweist.
    [49] Zellkultureinrichtung nach einem der Ansprüche 44 bis48, die eine Messeinrichtung (70) aufweist.
    [50] Zellkultureinrichtung nach Anspruch 49, bei derdie Messeinrichtung eine Sonde (71) aufweist, die in derInkubatoreinrichtung im Wirts-Ei (4) angeordnet ist.
    [51] Zellkultureinrichtung nach einem der Ansprüche 44 bis50, die eine Antriebseinrichtung (60) zur Bewegung derInkubatoreinrichtung aufweist.
    [52] Verwendung von einem Ei eines Wirts-Organismus zurKultivierung von biologischen Zellen, insbesondere Stammzellen,die nicht vom Wirts-Organismus stammen.
    [53] Verwendung von einem Ei als Inkubatoreinrichtungfür vonaußenin das Ei eingesetzten biologischen Zellen, insbesondere Stammzellen.
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